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La fragmentation de l’ADN du sperme (DFI) : Définition, Causes et conséquences

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Introduction :

Il y a quelques années, l’évaluation de la qualité du sperme était basée exclusivement sur le nombre de spermatozoïdes, leur vitalité (% de vivants), leur morphologie (surtout flagelles et acrosome), et une forme succincte d’analyse du mouvement, linéarité dans les trajets (TD : trajets directs). Ensuite, sous l’impulsion de D. Evenson en 1980, on a commencé à s’intéresser à la qualité du noyau, indépendamment des aspects génétiques ; à savoir qualité/intégrité (fragmentation) et structure tertiaire/compaction de l’ADN (condensation). L’analyse des causes du dérèglement ont progressé avec la mise en cause du stress oxydant mais aussi de la méthylation et de sa relation avec non seulement la stabilité de l’ADN mais aussi de son impact sur l’acquisition de l’épigénèse

Causes de fragmentation (voir figure 1)

Les cassures des brins d’ADN spermatiques peuvent prendre des formes multiples.

Elles sont, d’une façon globales produites par le stress oxydant. Toutes les bases de l’ADN sont susceptibles d’être oxydées

 

Tableau 1 : Les bases nucléaires et leurs produits d’oxydation. La Méthyl cytosine forme de la Thymine après désamination.

Indépendamment des ROS  (Reactive oxygen Species) molécules oxygénées réactives, comme les peroxydes, les perturbateurs endocriniens (EDCs) comme le bisphénol induisent également des dégâts liés au stress oxydant (SO) (Menezo et al. 2016, Aitken et Lewis 2023).

L’infection est aussi une source de fragmentation via le stress oxydant mais pas dans tous les cas.

Des erreurs méiotiques lors des divisions des cellules germinale entrainant une apoptose abortive est aussi source de cassure de l’’ADN, après liaison de Fas, qui est un récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNF-R).

L’isoforme C>677T du gène de la MTHFR et son corollaire l’hyperhomocystéinémie augmente également la fragmentation de l’ADN, via différents mécanismes notamment la diminution de la formation du glutathion qui est un antioxydant puissant. La varicocèle augmente aussi la fragmentation

 Pour autant, il faut considérer deux aspects dans ces causes de fragmentation de l’ADN spermatique :

1-Les cassures « directes » liées plus ou moins à des déformations des structures de l’ADN.  Ainsi le stress oxydant (SO) produit des sites « abasiques ». La base correspondante a été oxydée puis dégradée et a pu disparaitre entrainant cette cassure. C’est notamment le cas de la guanosine qui est très sensible au SO. Mais toute déformation de structure, comme la formation d’adduits, les liaisons parasites inter-brins sont susceptible de provoquer des cassures en amont ou en aval de ces dégâts. Il faut ici rappeler que la défense contre le SO diminue avec l’âge ce qui impacte la méthylation de l’ADN (Barnwell et al. 2025), donc la transmission épigénétique ; Ces dégâts de l’ADN sont normalement réparés dans toutes les cellules …  Sauf pour les spermatozoïdes qui ne possèdent pas d’ingénierie de réparation de l’ADN. Sa forme compactée n’empêche pas l’accès aux diverses sources de SO. Et ceci in vivo comme in vitro

2- Les cassures secondaires :En amont de la spermiation, les cellules germinales possèdent une capacité de DNA repair complète (nucleotide excision repair (NER), base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), and double-strand break repair (DSBR). Mais des cassures secondaires provoquées par des erreurs de réparation de l’ADN (DNA repair) vont provoquer des déformations de structure puis des fragmentations (Talibova et al. 2022, Aitken and Lewis 2023) et des anomalies méiotiques.  

Là encore, on doit prendre en compte 2 points : la protection contre le SO diminue avec l’âge, tout comme la capacité de réparer l’ADN. L’apoptose de certains spermatozoïdes induit aussi parfois des dégâts collatéraux sur d’autres spermatozoïdes a priori sains

Les techniques d’analyses de la fragmentation de l’ADN spermatique.

Il existe plusieurs types d’analyse quels que soient les réactifs utilisés.

Tout d’abord, il est bien évident que les techniques d’analyse sur lame sont beaucoup moins fiables et reproductibles que celles réalisées par cyrtométrie de flux. Les biais principaux sont tout d’abord le nombre de cellules analysées : 10 000 à 20 000 en cytométrie de flux vs 100 ou moins en analyse sur lame, et le problème d’homogénéité de la prise d’échantillon et la zone de lecture est sont beaucoup plus aléatoires quand l’analyse est réalisée sur lame, Enfin la perméabilisation des cellules aux réactifs est sur lame un vrai problème en fonction de la température etc… Enfin l’analyse sur lame est bien trop operateur dépendant.

Un autre point important mérite que l’on s’y attarde : le pré analytique. Les dégâts du stress oxydant s’accentuent post éjaculation, surtout si l’on considère que la teneur en oxygène de l’air du laboratoire et globalement 3 fois plus importante que dans les vois génitales. Ainsi soit l’analyse du DFI est faite immédiatement post liquéfaction et non pas après la réalisation du spermogramme. Soit si le test n’est pas réalisé sur sperme frais la congélation du sperme doit être réalisée immédiatement post liquéfaction. Nous verrons plus loin l’impact du SO in vitro en fonction de la technique de PMA utilisée (Bungum et al. 2004 )

 

Utilisation et interprétation des tests

L’estimation de la fragmentation n’est pas normalement un test du sperme de première intention. C’est un ajout au spermogramme, bien qu’il n’y ait pas forcement de corrélation entre les valeurs du spermogramme et les valeurs de la fragmentation. Ainsi ce n’est pas parce qu’un spermogramme est normal que la fragmentation de l’ADN spermatique ne sera pas élevée. Ce test devra plutôt être demandé devant des échecs de tentatives d’AMP, d’infertilité inexpliquée ou de fausses couches à répétition (avec d’autres examens)

Analyse sur lame :

  • Le Tunel : terminal Deoxynucleotidyl Transférase dUTP Nick End labelling ; La fixationde nucléotide fluorescent permet de mettre en évidence les cassures des brins d’ADN. La coloration a l’acridine orange sur lame : elle est quasiment totalement abandonnée.  Le Halo test (SCD méthode) sur lame couverte d’agar : l’intensité du halo de dispersion des bouts d’ADN indique plutôt une dégradation du noyau (fragmentation + décondensation). Cette méthode n’est pas considérée comme une méthode de référence.
    Le Comet assay est une méthode d’analyse électrophorétique après dénaturation par détergeant et traitement alcalin élevé. L’électrophorèse induit la formation d’une « comète » en fonction des poids moléculaires, la longueur de la queue de la comète est proportionnelle à la quantité de cassures. Cette technique est bonne mais assez compliquée ; le reproche le plus souvent formulé est que le traitement alcalin fort induit une fragmentation marginale secondaire de l’ADN (détermination par excès). Cette technique nécessite une expertise soutenue

Analyse par cytométrie de flux : comme indiqué précédemment, la cyrtométrie de flux est réellement la seule technique significative, informative et reproductible ; notamment parce qu’elle analyse un grand nombre de spermatozoïdes. Deux techniques s’imposent alors : le TUNEL et le dosage a l’acridine orange, type SCSA.  Les deux techniques permettent une analyse, avant et après congélation, et pour les très faibles numérations après concentration post centrifugation si nécessaire (Conti et al. 2024).

La technique à l’acridine orange utilise un fluorochrome qui réémet en rouge et en vert selon que l’ADN est fragmenté ou non.; Cette technique permet l’analyse d’un plus grand nombre de spermatozoïdes. Le dosage détecte bien les cassures des simples brins et doubles brins d’ADN (Aravindan 1997). L’intensité de la coloration rouge détecte les cassures d’ADN et l’intensité de la coloration verte mesure la décondensation de l’ADN en relation avec une certaine immaturité. (Santi et al. 2018) ; ce que ne fait pas la technique TUNEL. Ce paramètre est intéressant comme indicateur global de la condensation de l’ADN en relation avec la méthylation de l’ADN et des histones associées.  Pour Conti st al. (2024) ce dosage est le meilleur du fait que spécifiquement il minimise les différences inter laboratoires et inter manipulateurs.

            La technique Tunel par cytrométrie de flux est aussi un dosage robuste. Il est recommandé de l’associer à une coloration globale du noyau (ce qui ne simplifie pas le protocole) pour bien trancher entre spermatozoïdes et les « semen apoptotic bodies » présent en quantité dans le sperme des patients subfertiles et non identifiés/séparés par la cytométrie de flux (Conti et al.  2024), d’où ceci peut expliquer d’une part une sous-estimation des valeurs observées, et d’autres part dans certaines situations, une absence de corrélation entre la technique TUNEL et la technique à l’acridine orange.

            Pour ces deux tests les valeurs critiques se situent autour de 30% de SDF/DFI. La technique à l’acridine orange (SCSA) donne aussi une valeur de décondensation de l’ADN spermatique (coloration verte) dont le seuil pathogène se trouve autour de 30%.

Le test du taux de fragmentation post migration ne présente pas d’intérêt, il peut assurer un « faux confort », du fait de son abaissement.

 

Les conséquences de la fragmentation de l’ADN spermatiques et l’approche thérapeutique

L'augmentation de la fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes n’empêche pas le processus de fécondation, qui n’est vraiment pas un aboutissement, mais seulement un prérequis de départ. Le spermatozoïde, au-delà de son génome, apporte les informations épigéniques et d’empreinte (liées à la méthylation de l’ADN et des histones). Il participe à la régulation de la croissance placentaire de l’implantation du développement embryonnaire. Des fausses couches très tardives sont observées dans le cas de DFI très élevé.  Il faut aussi rappeler que :
- le stress oxydant affecte aussi la méthylation de l’ADN du spermatozoïdes
- les deux génomes (paternel et maternel) ne sont pas équivalents mais complémentaires et que tout défaut de méthylation de ces génomes affectera les expressions géniques.

Si la fragmentation impacte des gènes majeurs de régulation (housekeeping) du développement les conséquences seront immédiates. Ainsi la recherche d'anomalies de l'ADN spermatique permet aussi de minimiser les risques de santé des enfants à naître ; en l’occurrence des maladies d’empreinte et d’épigénèse.

 

Fragmentation,  technique de PMA et grossesse :  Dans un excellent travail, Begum et al. (2004) ont clairement montré l’impact des conditions in vitro, en l’occurrence de la teneur en oxygène ambiant sur les dégâts de l’ADN. En corrélant la relation DFI élevé avec 1-Insemination artificielle, 2-FIV classique, 3-ICSI, elle montre que les résultats les meilleurs sont obtenus en ICSI. En effet, moins le sperme passe de temps à l’air libre avant fécondation, meilleurs sont les résultats.

In vivo, le passage dans les voies génitales de la femme n’améliore rien. D’autant que des inflammations résiduelles peuvent intervenir.
In vitro, les dégâts perdurent après élimination du liquide séminal (préparation du sperme pour AMP) voire s’accélère, bien que la corrélation entre potentiel antioxydant du plasma séminal et fragmentation de l’ADN n’ait jamais été démontrée au contraire. Il semble y avoir une indépendance parfaite des deux paramètres.
La fragmentation affecte négativement la qualité embryonnaire (Alvarez Cedo et al. 2017) avec une conséquence dramatique sur l’augmentation des fausses couches (Li et al.2024, Venkatesh et al. 2011) et des sur le poids des enfants à la naissance ?

Pour ce qui est des traitements anti-oxydants, les vitamines « antioxydantes » ont très nettement montré leurs limites (Menezo et al. 2014) : elles aggravent même la décondensation de l’ADN du noyau (Menezo et al. 2007).  Des traitements plus sophistiqués, basés sur une recherche plus fondamentale (Gallo et al.2018) et individualisés doivent être prescrits ; ils doivent inclure des polyphénols (quercétine), la superoxyde dismutase (SOD). Il ne faut pas oublier l’osmose négative Stress Oxydant/ anomalies de la méthylation, comme mentionné plus avant, avec l’homocystéine comme support (d’où l’importance de son dosage en pré-conceptionnel). Les traitements ne peuvent absolument pas se réduire à un traitement vitaminique. Il n’existe pas de traitement universel (« one size fits all ») pour traiter la fragmentation ; chaque cas devant être discuté notamment en fonction des causes de ces augmentations de fragmentation de l’ADN spermatique (varicocèle, toxiques, environnement, mutation MTHFR, etc …).

 

Conclusions

La fragmentation de l’ADN n’est pas un examen de première approche ; la technique la plus fiable est la cytométrie de flux pour Acridine/SCSA ou TUNEL. Elle n’a pas nécessairement de corrélation avec la morphologie, la vitalité et la morphologie des spermatozoïdes.  Pour autant, elle doit être prise en compte notamment pour les infertilités plus ou moins inexpliquées de longue durée. Il n’y a pas de traitement universel pour la faire baisser ; il faut sortir des traitements standards poly vitaminiques/poly minéraux qui contiennent souvent vitamine A, E et C (qui deviennent ensuite pro oxydantes) et fer, cuivre, sélénium et zinc non chélaté. Mais les possibilités existent après parfois avoir tâtonné quelques temps.

 

 

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