Le domaine de la procréation médicalement assistée n’est pas à l’abri d’informations non étayées, de recettes « magiques » qualifiées de « très importantes » qui en réalité peuvent perturber les patients, sont d’intérêts nuls et peuvent au contraire être pénalisantes. L’aspect financier de certaines assertions est souvent évident.
La baisse de la quantité des spermatozoïdes ne fait plus débat. Les disrupteurs /perturbateurs endocriniens et l’environnement, plus généralement, en sont en partie la cause. Ces observations ont amené à une analyse plus approfondie des spermatozoïdes, et en l’occurrence de la qualité du noyau.
Deux types principaux de dégâts sont observés. La Fragmentation de l’ADN (cassure) et la décondensation du noyau (relâchement de sa compaction/structure tertiaire). Celles-ci sont nécessaires à une bonne qualité de la fécondation et des premières divisions embryonnaires. Il faut noter que le spermatozoïde ne possède pas de capacité de réparation de l’ADN (contrairement aux spermatocytes, aux spermatides et aux ovocytes matures).
Les cassures les plus fréquentes :
*Pertes d’une base dans la séquence (AP) : très souvent liée au stress oxydant, classique en andrologie. La base la plus affectée est la guanine : 10.000 à 20.000 dégâts de ce type se produisent par cellule et par jour
*Cassure d’un brin d’ADN (SSB) : peut se produire plusieurs fois par minute
*Cassure du double brin (DSB) : peut se produire plusieurs fois par jour
Tous ces dégâts, doivent être réparés par l’ovocyte qui est « normalement » équipé pour cela (à condition d’avoir un ovocyte mature, le plus efficace étant chez une femme jeune)
Les techniques d’analyse des cassures
Le Tunel : fixation d’un composé fluorescent au niveau des cassures. Très efficace pour détecter tous types de cassures. Associée à la cytométrie de flux, elle permet une analyse sur près de 10.000 spermatozoïdes
Le SCSA (Sperm Chromatine Structure Assay) : Mis au point par Don Evenson dès 1968, consiste en la fixation de l’acridine orange au niveau des cassures, en milieu acide. La petite taille de ce colorant donne un accès meilleur aux cassures. Il est toujours associé à la cytométrie de flux permettant une analyse sur environ 10.000 spermatozoïdes. Il détecte tous les types de cassures. Il est considéré comme le Golden Standard et il permet de mesurer simultanément cassures (fragmentation) et décondensation de l’ADN ce qui n’est pas le cas de la technique TUNEL
Technique COMET à Ph neutre ; analyse sur une centaine de spermatozoïdes. Elle est supposée détecter plutôt les DSB (cassures doubles brins). Elle présente des inconvénients : elle est difficile à mettre en œuvre, elle est opérateur dépendant (peu de laboratoire la pratiquent) et le nombre de spermatozoïdes analysés est réduit à une centaine.
Aspects mythiques : tous les dégâts sont importants et doivent être analysés
Certaines publications récentes amènent à penser que seules les cassures doubles brins sont importantes. Il est vrai que le système de réparation est plus lourd en cas de cassure doubles brins et que seul le COMET permet de séparer cassure double brin de cassure simple brin. Mais ceci est basé sur un manque de connaissance des dégâts de l’ADN et de leur mécanisme de réparation.
*La fréquence des pertes de base est majeure. Les conséquences d’une non-réparation sont très importantes : elles bloquent la transcription et la réplication et sont potentiellement muta-géniques du fait d’erreurs de réparation par un processus appelé « A rule : règle du A »de réparation des AP (un site AP est un site abasique, c’est-à-dire une absence de base sur la séquence d’ADN). De ce fait les sites AP sont des lésions non instructives (ne fournit pas d’instruction d’appariement) ce qui perturbe la lecture par les ADN polymérase, entrainant des erreurs de réplications de l’ADN, des erreurs de synthèse de protéines par non-reconnaissance du codon, d’où des erreurs des processus de fécondation et de développement embryonnaire. La présence de nombreux sites AP proches les uns des autres sont source d’erreurs de tous types.
Ce phénomène est très important pour les codons méthionine et tryptophane qui contiennent de la guanine, très sensible à l’oxydation.
Ces pertes de bases quand elles sont nombreuses et rapprochées peuvent générer des cassures du brin d’ADN (SSB) par une endonucléase ou une lyase
Les cassures monobrins (SSB) peuvent générer ensuite des cassures doubles brins (DSB). De plus les sites abasiques (AP) peuvent se transformer directement en cassures double brin de l’ADN (DSB) lorsque plusieurs lésions simple brin sont situées à proximité l’une de l’autre sur les deux brins opposés de l’ADN, formant ainsi une lésion groupée
S’il est vrai que les cassures doubles brins sont considérées comme les plus toxiques, les autres dégâts ne doivent être sous-estimés. Le faire serait ignorer les dynamiques d’évolution des dégâts et de leur réparation (ou pas) de l’ADN, phénomènes continus s’il en est.
Le meilleur exemple est fourni par les travaux de Bungum et al (2019) qui montrent que les dégâts de l’ADN augmentent lors de la co-incubation ovocytes-spermatozoïdes in vitro et même lors de la remontée des spermatozoïdes dans l’utérus et la trompe lors d’insémination artificielle.
L’analyse des dégâts doit donc impérativement être globale donc par Tunnel ou SCSA, qui détectent TOUTES les cassures. S’en tenir au DSB est contreproductif.
La qualité de l’échantillon analysé est aussi importante. L’hétérogénéité et le faible volume du prélèvement, ainsi que le non-respect des conditions pré-analytiques peuvent être source d’artefacts d’erreurs dans les analyses de la qualité de l’ADN spermatique. Il est important de rappeler ici que le sperme doit être congelé dès la fin de la liquéfaction et non pas laissé à température ambiante ce qui faussera le résultat.
Il est donc certain que tous les dégâts doivent être analysés et qu’il n’y a pas d’intérêt à séparer les cassures doubles brins des cassures simple brin.
Le problème final réel étant la capacité de l’oocyte à réparer les dégâts apportés à l’ADN du sperme.
Les patients doivent être informés que tous les types de dégâts de l’ADN sont importants, toute hiérarchisation est actuellement du domaine de la supputation.
Impact sur le développement embryonnaire
D’un point de vue finaliste/Holistique, il est parfaitement cohérant que la transcription du génome embryonnaire ne commence que le 3eme jour post fécondation. Une transcription sur un ADN endommagé serait catastrophique (Arrêts/erreurs…. ). La conclusion finaliste est que l’ovocyte a 3 jours pour réparer les anomalies apportées par le spermatozoïde et celles induites lors des premières réplications. D’où l’importance de la « qualité » de l 'ovocyte et de sa capacité de « House keeping/ réparation de l’ADN » pendant cette période.
Image de fragmentation et de décondensation de l’ADN des spermatozoïdes par coloration à l’acridine orange en cytométrie de flux
Diagrammes SCSA, analyse sur plus de 10 OOO spermatozoïdes, cytométrie de Flux. Tous les différents types de dégâts sont pris en compte
Références :
Sperm DNA fragmentation testing: Summary evidence and clinical practice recommendations.
Andrologia. 2021 Mar;53(2):e13874. doi: 10.1111/and.13874. Epub 2020 Oct 27.PMID: 33108829
Functional Aspects of Sperm Chromatin Organization.
Results Probl Cell Differ. 2022;70:295-311. doi: 10.1007/978-3-031-06573-6_10.PMID: 36348112
Eight tests for sperm DNA fragmentation and their roles in the clinic.
Transl Androl Urol. 2017 Sep;6(Suppl 4):S468-S470. doi: 10.21037/tau.2017.03.78.PMID: 29082163
Fertil Steril. 2019 Jul;112(1):46-53.e2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2019.03.013. Epub 2019 Apr 28.PMID: 31043234
Transl Androl Urol. 2017 Sep;6(Suppl 4):S553-S556. doi: 10.21037/tau.2017.03.11.PMID: 29082177