INTRODUCTION
L’aneuploïdie qui affecte près de la moitié des embryons pré implantatoires, est une des causes principales des échecs d’implantation, des arrêts de développement embryonnaire, des pertes de grossesse et des anomalies congénitales. L’aneuploïdie est due soit à un accident durant la méiose ou au moment de la fécondation (uniforme), soit à un accident mitotique (mosaïque : avec cellules euploïdies et cellules aneuploïdes). L’âge maternel est connu pour être un facteur crucial d’aneuploïdie. Il a été suggéré que les interventions médicales pouvaient aussi en être responsables.
L’hyperstimulation durant la FIV a pour objectif de récupérer un nombre spécifique d’ovocytes pouvant conduire des embryons euploïdies. Il a été montré chez l’animal qu’une super ovulation induite avec des doses élevées de gonadotrophines avait un effet négatif sur le développement de l’ovocyte et sur le caryotype de l’embryon. Cependant, les études sur la femme durant une AMP ont montrées des résultats contradictoires : certaines montrent que l’incidence de l’aneuploïdie est affectée par la dose des gonadotrophines exogènes, par le type de protocole de stimulation, par la durée de la stimulation, et le nombre d’ovocytes récupérés ; d’autres études n’ont pas retrouvé ces résultats.
L’hétérogénéité des populations étudiées pourrait être une explication à ces résultats contradictoires. Dans la majorité des cas, il s’agissait de patientes qui bénéficiait d’un test génétique pré implantatoire (PGT-A) pour connaître le statut chromosomique de l’embryon (Aneuploidie) dans le cadre d’indications variées : avortement à répétition, échec d’implantation, âgé avancé, teratospermie sévère ou simple demande parentale de contrôle.
Le stade embryonnaire (J3 ou J5-6) au moment de la biopsie est également un autre élément à considérer. Les études concernant les biopsies à J3 ont retrouvé plus d’aneuploïdie en lien avec l’hyper stimulation et l’hyper réponse. Et à l’inverse, celles avec des biopsies de trophectoderme (J5) n’ont pas retrouvé cette corrélation. Une des hypothèses est que l’aneuploïdie arrête le développement embryonnaire à J3 et empêche d’obtenir un certain nombre de blastocystes qui ne sont donc pas inclus dans les analyses. Une autre hypothèse est que des embryons aneuploïdies peuvent éliminer les cellules anormales et devenir des blastocystes euploïdies. Il parait également important d’explorer les effets de la stimulation ovarienne et sa réponse sur la qualité des ovocytes et des embryons avant le stade blastocyste avec le taux de fécondation et de blastulation.
Pour limiter l’influence d’un biais de sélection, les auteurs ont proposé d’explorer ces résultats contradictoires dans une large cohorte de patientes ayant recours à un PGT- M (Monogenic) pour une recherche d’anomalie génique maternel ou paternel (qui permet également de connaître le statut chromosomique de l’embryon). Comparativement aux autres PGT, il n’y a pas de sur-risque d’avoir des anomalies chromosomiques dans la population.
METHODES
- Sujets de l’étude
Toutes les données cliniques proviennent des cycles avec PGT - M réalisés dans le centre d’AMP de Beijing (Chine) avec des couples qui avaient déjà eu, au moins, un enfant avec maladie génétique (mono génique) et qui n’ont pas été diagnostiqués avec une infertilité, entre Juin 2014 et Juillet 2021. Les couples avec un risque, a priori, augmenté d’embryons avec anomalies chromosomiques ont été exclus (membre porteur d’un caryotype anormal, avortements récurrents, échecs d’implantation et tératospermie sévère). Pour tenir compte de l’impact de l’âge maternel avancé, les auteurs ont crée différents sous groupes d’âge pour les femmes participant à l’étude. De plus, il a été montré que la réserve ovarienne diminuée avaient un impact sur le taux d’aneuploïdie et c’est pourquoi ces femmes avec AMH < 1,1ng/mL, CFA < 5-7 ou FSH basal > 10 UI/L ont été exclues de l’analyse. Cette étude a été validée par le comité d’éthique de l’université de Pékin.
- Traitement
Le protocole de stimulation, le déclenchement final de la maturation ovocytaire, la ponction folliculaire, et la fécondation ont été réalisés selon les protocoles habituels déjà décrits. Les femmes ont pu bénéficier de 4 types de protocole : antagoniste, agoniste long, agoniste ultra long et agoniste court. Suite au blocage, la stimulation a été faite avec les gonadotrophines recombinantes. Pour les patientes avec protocole court, les gonadotrophines et l’agoniste court ont été administrés simultanément à J2/J3 du cycle. Pour les protocoles antagonistes, les gonadotrophines ont été débuté à J2 et l’antagoniste a été introduit lorsqu’il y a avait au moins un follicule de 12mm de diamètre et poursuivi jusqu’au jour du déclenchement. Une HCG recombinante 250 μg a été administrée pour déclencher lorsqu’il y a avait au moins 2 follicules avec un diamètre ≥ 18 mm ou 3 follicules ≥ 17 mm. La ponction était réalisée 36 h plus tard.
- Protocole de laboratoire
Tous les ovocytes ont été inséminés par ICSI exclusivement, 4 à 6 h après le recueil. Seuls les ovocytes avec exclusion du 1er globule polaire (Métaphase 2) ont été injectés. La fécondation a été validée 16 à 18h après, par la présence de 2 pro nuclei. La qualité embryonnaire a été évaluée 68 à 72h après, selon les critères du consensus d’Istanbul. L’évaluation de la morphologie a été faite selon la classification de Gardner et les blastocystes de bonne qualité (A/A, A/B et B/A) et moyenne qualité (B/B) ont été sélectionnés pour une biopsie faite à J5 ou J6 selon le temps de blastulation. Seulement en l’absence de ces embryons, les embryons B/C et C/B ont été utilisés pour la biopsie. Les embryons de mauvaise qualité (C/C) ont toujours été exclus. Après immobilisation de l’embryon, la zone pellucide a été perforée avec des pulses de laser et une pipette a biopsie de 20 μm a été utilisée pour aspirer 5 à 10 cellules pour le PGT – M.
- Analyse du PGT-M
Le diagnostic pré implantatoire PGT-M a été réalisé avec les techniques de nouvelle génération (Next Generation Sequencing) : « Mutated allele reveated by sequencing with aneuploidy and linkage analyse (MARSALA) » qui permettent la recherche simultanée d’un gène muté (Echange d’un nucléotide détecté par amplification avec PCR), et l’étude de la ploïdie (variation du nombre de copie)
Les embryons avec moins 30 % de cellules aneuploïdes ont été considérés comme euploïdies, ceux avec 30 à 70 % ont été classés « mosaïques » et ceux avec plus de 70 % ont été considérés comme aneuploïdes.
- Résultats
Pour l’analyse des résultats, 5 groupes ont été crées selon l’âge maternel : < 30 ans , 31-34 ans, 35-37 ans, 38-40 ans et > 41 ans.
L’analyse principale était le taux d’embryons euploïdies (embryons euploïdies / embryons biopsiés). Les analyses secondaires concernaient le taux de fécondation (embryons 2PN / ovocytes MII) et le taux de blastulation (blastocystes / embryons 2 PN)
RESULTATS :
Au total, 642 couples ont bénéficié d’un PGT-M et 17 ont été exclus pour caryotype anormal et 8 pour antécédent de maladie avortive. Donc, 617 patientes âgées de 22 à 45 ans, ont été incluses dans l’étude avec 867 cycles avec PGT-M, 12874 ovocytes récupérés et 3106 blastocystes biopsiés. L’IMC moyen augmentait avec les classes d’âge. Le taux médian d’AMH diminuait graduellement de 3,25ng/mL pour les femmes < 30 ans à 0,8 ng/mL pour celles de plus de 40 ans. De même, la FSH basal à J2 augmente avec l’âge. Et 33 femmes ont été diagnostiquées avec une réserve ovarienne altérée : 1,6 % chez des femmes < 30 ans, 3% des 30-34 ans, 5,5% des 35-37 ans, 13,7 % des 38-39 ans et 55,6% des > 40 ans. Les cycles de ces 33 femmes seront exclus des analyses.
La fréquence des protocoles de stimulation utilisés était la suivante : Antagoniste (635 cycles, 76,5%), Agoniste protocole long (153 cycles, 18,4%), Agoniste ultra long (29 cycles, 3,5%) et Agoniste court (13 cycles, 1,6%). Les femmes de > 38 ans avaient des doses totales de gonadotrophines supérieures à celles de < 35 ans. Cependant, il n’a pas été retrouvé de différence concernant la durée stimulation au travers les 5 groupes d’âge.
La réponse à la stimulation, évaluée par le nombre d’ovocytes récupérés, diminuait avec l’âge de la femme avec une médiane à 16 pour les < 30 ans et à 7 pour les > 40 ans. Et par conséquent, le nombre d’ovocytes en MII, d’embryons 2 PN, de blastocystes biopsiables et d’embryons euploïdes diminuait également avec l’âge maternel.
Cependant, le taux d’ovocytes matures, de fécondation et de blastulation était comparable dans toutes les catégories d’âge. Seul le taux médian d’euploïdie diminuait avec l’âge avec 66% chez les femmes de < 35 ans et diminuait fortement après avec 50 % entre 35 et 39 ans puis 0 % après 40 ans. La prévalence des cycles avec au moins 1 embryon euploïde diminuait également avec l’âge avec 90 % chez les femmes < 30 ans à 30,4% chez les plus de 40 ans.
Parmi les 3106 embryons biopsiés, 1969 (63,4%) étaient euploïdes, 566 (18,2%) étaient aneuploïdes et 379 (12,2%) étaient mosaïques euploïdies et 147 (4,7%) étaient mosaïques aneuploïdes. Le taux d’euploïdie chute à partir de 32 ans, et diminue significativement à partir de 34 ans. L’aneuploïdie est le plus souvent due au chromosome 16 ou 22.
Après exclusion des ROA, 830 cycles avec PGT-M ont été analysés pour évaluer l’impact de la stimulation ovarienne sur le taux d’euploïdie, le taux de fécondation et le taux de blastulation. Les différents paramètres de stimulation tels que le type de protocole, la dose initiale et la dose totale de gonadotrophines, la durée de stimulation et la supplémentation en HMG, ont eu des taux d’euploïdie comparable, dans toutes les classes d’âge. De même, la réponse à la stimulation correspondant au nombre d’ovocytes récupérés n’a pas d’effet sur le taux d’euploïdie dans toutes les classes d’âge. Il est à noter que la taille du groupe des > 40 ans est faible et conduit à un pouvoir statistique relativement faible.
Tous les paramètres de stimulation sont associés un taux comparable de fécondation dans tous les groupes d’âge. Mais il semble que quelques paramètres de la stimulation influencent le taux de blastulation tel que le type de protocole, la dose initiale et la dose totale de gonadotrophines, la supplémentation en HMG et le nombre d’ovocytes récupérés en particulier dans le groupe de 31-35 ans. Et après régression linaire, la dose initiale de gonadotrophines et le nombre d’ovocytes récupérés restent statistiquement significatifs. Curieusement, la dose initiale de gonadotrophines a des effets contraires selon les classe d’âge : le taux de blastulation diminue avec la dose initiale chez les 31-34 ans mais augmente chez les 35-37 ans. Le taux de blastulation tend à diminuer avec l’augmentation du nombre d’ovocytes récupérés avec une significativité statistique chez les 31-34 ans, 35-37 ans et 38- 40 ans.
CONCLUSION
Les auteurs ont évalués les effets de la stimulation ovarienne sur l’euploïdie embryonnaire au travers des cycles de FIV avec PGT-M. Il a été retrouvé que les paramètres de la stimulation tels que l’augmentation de la dose initiale de gonadotrophine, la stimulation prolongée ainsi que le nombre total d’ovocytes récupérés n’avaient pas d’impact significatif sur le taux de blastocystes euploïdes. Cependant, certains paramètres en lien avec la stimulation ovarienne et la réponse ovarienne avaient un impact sur le taux de blastulation dans certains groupes d’âge et plus particulièrement la baisse du taux de blastulation avec l’augmentation du nombre d’ovocytes récupérés chez les femmes âgées de 31 à 40 ans.
Les effets de la stimulation ovarienne n’ont pas été bien étudiés. Une revue de 15 études publiées entre 2007 et 2019 (Rodriguez-Purata et al) et des études plus récentes n’ont pas pu aboutir à des résultats concluants à cause de différents facteurs : (1) variations dans les populations étudiées, (2) biopsies réalisées à différents âges embryonnaires et (3) évolution des outils d’évaluation de la ploïdie. Irani et al ont étudié 2230 cycles avec PGT-A avec de l’hybridation aCGH/NGS pour évaluer le taux d’euploïdie des blastocystes et n’ont pas retrouvé d’impact de la stimulation ovarienne et de la réponse ovarienne. Des conclusions équivalentes ont été également retrouvées dans d’autres études similaires avec aCGH/SNP en comparant le taux de blastocystes aneuploides sur 369 cycles naturels et 2486 patientes avec stimulation ovarienne pour FIV. En 2007, Baart et al (2009) avaient comparé, dans un essai randomisé incluant 111 patientes sans facteur de risque d’anomalies chromosomiques, la ploïdie d’embryons (précoces) obtenus après mild stimulation ou stimulation conventionnelle forte dose et analysés par hybridation in situ. Ils retrouvaient un taux d’euploïdie plus bas dans le groupe avec les fortes doses de gonadotrophines. Haalf et al (2009) retrouvaient, en analysant le 1er globule polaire (qui est le reflet indirect de la ploïdie de l’embryon) avec de la FISH, qu’il y a avait un taux important d’erreur chromosomique après stimulation ovarienne chez les femmes de plus de 40 ans.
L’analyse des études sur le sujet a montré qu’il n’y avait pas d’impact de la stimulation sur l’euploïdie au stade de blastocyste quelque soit la population étudiée. Les résultats de l’étude présentée ici sont similaires dans la population avec PGT – M. Et ces résultats sont importants car la population ne présente pas de sur-risque d’anomalies chromosomiques contrairement à celles du PGT-A ou SR, et apportent donc une preuve plus convaincante du non-impact de la stimulation sur la ploïdie.
Les biopsies du trophectoderme au stade blastocyste apportent des informations plus précises sur la ploïdie que les biopsies au stade précoce, à cause de l’instabilité chromosomique dans les stades précoces de l’embryon humain. Mais, seuls les embryons utilisables ont été biopsiés et les embryons qui ne sont pas développés pas jusqu’au stade de blastocystes, possiblement à cause d’une anomalie chromosomique, ne n’ont pas été comptés. Il etait donc nécessaire d’étudier l’impact de la stimulation sur la fécondation et la blastulation qui reflètent la compétence de l’ovocyte avant ce stade. Dans cette étude, il apparaît que le taux de blastulation diminue significativement lorsque le nombre d’ovocytes récupérés augmente chez les femmes de 31 à 40 ans et ceci est cohérent avec l’étude de Rubio et al. (2010) qui retrouvait une augmentation du taux de blastulation chez les donneuses d’ovocytes forte répondeuses, lors du 2ème cycle réalisé avec des doses de gonadotrophines moindres. Compte tenu de l’étude de Baart et al. (2007) qui démontrait une corrélation négative entre le taux un dosage plus élevé de gonadotrophines et le taux d’euploïdie au stade de clivage embryonnaire et celle de Haaf et al. (2009) qui indiquait qu’un plus grand nombre d’ovocytes obtenus était associé à un plus grand risque d’anomalies chromosomiques, une hypothèse plausible émerge : une réponse ovarienne excessive pourrait contribuer à des anomalies chromosomiques dans les premiers stades de développement de l'embryon et bloqueraient ainsi leur progression jusqu'au stade de blastocyste. Donc, seuls les embryons atteignant avec succès le stade de blastocyste sont sélectionnés pour les biopsies TE, ce qui n'affecte pas les taux d'euploïdie des blastocystes.
Une tendance à la baisse du taux de blastulation a été observée chez les femmes de < 30 ans et > 40 ans, sans atteindre le seuil de significativité. L’explication possible serait que l’âge maternel joue un rôle déterminant dans ces 2 classes d’âge. Chez les < 30 ans l’âge maternel influence le taux d’euploïdie avec un effet suffisamment fort pour atténuer d’autres facteurs. Ceci peut expliquer les conclusions de Labarta et al. (2012) qui rapportaient que le taux d’euploïdie des embryons au stade du clivage chez de jeunes donneuses d'ovocytes (25,4 ans) n’était pas influencé par la stimulation ovarienne modérée en comparaison avec les cycles non stimulés. Mais chez les femmes > 40 ans, l’âge maternel a un effet déterminant et préjudiciable responsable du faible taux d’euploïdie et expliquant que les autres facteurs ont un effet moindre. Cette hypothèse est confortée par les conclusions de Haaf et al. (2009) qui rapportaient qu’un nombre important d’ovocytes recueillis était associé à une augmentation de l’euploïdie chez les femmes de < 40 ans mais pas chez celles > 40 ans.
Une autre découverte intéressante de cette étude est que la dose initiale de gonadotrophines a un effet contraire sur le taux de blastulation selon les différentes classes d’âge. Une dose initiale plus élevée entraine un taux de blastulation plus faible pour les femmes de 31-34 ans mais plus élevé pour celle de 35-37 ans. Les auteurs spéculent qu’une dose initiale plus faible suffit à recruter assez de follicules chez les femmes jeunes, mais, que chez les femmes plus âgées, une dose initiale plus élevée est nécessaire pour obtenir un nombre de follicule approprié. La raison pour laquelle ce phénomène n’a pas été observé chez les femmes beaucoup plus jeunes ou beaucoup plus âgées, contribue à valider la force de l’effet âge. Ces constatations doivent être confirmés par d’autres études.
La force de cette étude est l’homogénéité et le grand nombre de patientes incluses. Une autre force réside dans la précision de la plate forme PGT. Les limites sont le caractère rétrospectif et le nombre relativement faible de femmes > 40 ans, conduisant à une baisse de la puissance statistique. D’autres études avec des patientes en PGT-M sont nécessaires pour confirmer ces conclusions. Si on considère le taux d’euploïdie comme un indicateur de résultats, les auteurs n’ont pas analysé les effets de la stimulation ovarienne sur l’aneuploïdie uniforme ou mosaïque. Et comme le développement des embryons mosaïques fait actuellement débat et reste le sujet de nombreuses études, les auteurs sépareront les issues des aneuploïdies mosaïques et uniformes dans les études à venir. Les effets des caractéristiques paternels n’ont pas été pris en compte pour l’évaluation du statut euploïdie de l’embryon car l’aneuploïdie embryonnaire est principalement due à une erreur méiotique chez la mère (Rana et al, 2023). Mais les facteurs spermatiques pourraient avoir un effet sur le développement et sur le taux de blastulation et donc sur le nombre de blastocystes analysés. L’exclusion de patients avec une sévère tératozoospermie et le fait que seule l’ICSI ait été utilisée pour les femmes en PGT-M contribuent à minimiser les effets des facteurs paternels.
En conclusion, cette étude démontre que la stimulation ovarienne et la réponse ovarienne à la stimulation n’a pas d’effet sur l’euploidie des blastocystes ainsi que sur le taux de fécondation pour les patientes en PGT-M. Cependant, pour les femmes de 31 à 40 ans, il y a une diminution signification du taux de blastulation alors que le nombre d’ovocytes récupérés augmente, ce qui suggère que la stratégie thérapeutique pour ces femmes dans cette classe d’âge, ne doit pas avoir pour seul but d’optimiser le nombre d’ovocytes récupérés. Il est donc nécessaire de leur proposer des traitements individualisés et personnalisés en considérant particulièrement la relation complexe entre l’âge maternel est ses effets protecteurs ou néfastes sur la qualité de l’embryon dans cette classe d’âge.
COMMENTAIRE DU REDACTEUR :
Il s’agit d’une étude intéressante grâce au choix de la population bénéficiant d’une analyse du caryotype ((PGT-M) mais sans facteur de risque intrinsèque d’anomalies chromosomiques. L’effectif est relativement large et classé selon les tranches d’âge, bien que les femmes > 40 ans soient faiblement représentées.
Il apparaît donc que la stimulation ovarienne et la réponse à la stimulation n’influe pas sur le taux de ploïdie embryonnaire à J5 ni sur le taux de fécondation. Le taux de blastulation semble impacté par le nombre d’ovocytes récupérés selon les tranches d’âge.
Mais une question se pose par rapport à la pratique clinique et la dose de gonadotrophine initiale : faut il stimuler fort pour avoir un maximum d’ovocytes euploïdies (nombre absolu versus taux relatif) ?