Dans une première approche, 2 aspects sont à considérer : l’efficacité des méthodes de FIV/ICSI et la santé des enfants.

1-Les rendements par ovocyte ponctionné sont très faibles, les régulations endogènes de l’embryon amènent à l’apoptose phénomène de régulations bienvenus afin d’éviter une tératogénicité. Les anomalies chromosomiques ne sont qu une facette ultime de dérèglement biochimique. Il est évident que les milieux de culture ont, plus que probablement une certaine responsabilité

2- Même si on doit considérer que les études sur le suivi des procréations médicalement assistées sont globalement rassurantes, une certaine vigilance est nécessaire. Récemment ont été mis en évidence des phénomènes de dérégulation de méthylation/épigénétique. Cet aspect est plus difficile a cerner, car les conséquences sont variables dans les temps et peuvent sauter les génération en fonction du sexe. Les travaux les plus « problématiques » proviennent du Japon [1] ; Il semblerait que la FIV génère là, des anomalies d’empreinte prononcées. Pour cet aspect il est évident qu'une préparation plus appropriée dès la femme avant et après stimulation peut réduire certains effets négatifs.

Les deux aspects, épigénèse et développement embryonnaire harmonieux/efficace sont liés. Comme nous le verrons la cinétique du développement embryonnaire, sa qualité et l’acquisition/maintien épigénétique sont interdépendants. Contrairement à ce qui a été longtemps affirmé un développement pré-implantatoire rapide et qualité/potentialités embryonnaires ne sont pas synonymes.

Qualité des milieux et efficacité, Considérations générales : Plusieurs études, notamment les plus récentes indiquent un rendement pas ovocyte ponctionné ne dépassant pas 11.3%. (2). Bien sûr, une partie de la mauvaise qualité, provient, sans aucun doute, de la stimulation, néanmoins une partie des dégâts provient de la qualité de la culture. Il est par ailleurs assez évident que la liaison qualité morphologique/ qualité embryonnaire estimée en termes de potentiel de développement est parfois ténue.

Un bon exemple est donné par les paramètres biophysiques : tous les milieux commerciaux ont des osmolarité faible, autours de 270 millimoles. Elle est basée sur la culture de l’embryon de souris, qui ne peut se développer in vitro dans des milieux « physiologiques », reflétant l’osmolarité in vivo, à 290 milliOsmoles/kg.  L’environnement tubaire est à 290mOsm chez l’humain et chez la majorité des mammifères ; Cette hypo-osmolarité in vitro a une propension à légèrement augmenter le volume embryonnaire, améliorant certes sa qualité morphologique, mais dont les effets métaboliques réels sont inconnus. Le pH alcalin est maintenu grâce au bicarbonate, sous influence, in vivo d’une activité anhydrase carbonique forte. L’embryon est tout à fait capable de régulation autour de pH 7.5 +/-0.3 unités de pH ; La littérature n’est pas avare de publications indiquant une régulation du pH à la deuxième décimale : sans intérêt. Par contre le passage dessous une valeur de 6.8-7., est fortement délétère. L’embryon n’est pas équipé pour cela. Les 4 cations Na, Mg, K et Ca sont présents avec un taux de sodium un peu trop faible expliquant l’hyperosmolarité.   Un cation divalent est totalement absent de tous les milieux : le Zinc.  Le niveau intracellulaire de Zinc change dramatiquement pendant la maturation ovocytaire, la fécondation moment où l’ovocyte libère du zinc suite à l’activation. Puis le zinc augmente pendant le développement embryonnaire ; Il augmente très fortement au stade blastocyste. Ce n’est pas du tout paradoxale a partir du moment où la transcription embryonnaire démarre exponentiellement a partir du stade 6-8 Cellules (Maternal to Zygotic Transition). (3,4)

 Les ZnF, Zinc Finger Protéines sont des protéines à actions biochimique/moléculaire très variées : notamment la transduction, la régulation transcriptionnelle, elles sont des effecteurs majeurs de la transcription et de la réparation de l’ADN (« DNA repair ») : 3 paramètres importants, s’il en est, pendant le développement embryonnaire. Le zinc est un régulateur important des cycles des folates et de la méthionine (1-CC) , donc de la méthylation et de l’épigénèse. Les transporteurs de Zinc sont très fortement exprimés dans l’ovocyte et l’embryon

Pour les autres paramètres biochimiques, le glucose est présent mais a des taux inférieurs a la glycémie. Lactate et pyruvate sont des métabolites intermédiaires intéressants, généralement ajoutés dans les milieux.

Les vitamines ne sont généralement pas présentes dans les milieux, nous verrons plus loin que ceci peut être un lourd handicap pour certaines d’entre elles. La vitamine C est parfois ajoutée pour son pouvoir réducteur(antioxydant). Elle est connue pour stabiliser la cystéine, précurseur absolument nécessaire du glutathion ; le stabilisateur/antioxydant ubiquitaire.  Dans cette même rubrique, il a souvent été prétendu que la teneur en oxygène devait être maintenue à 5% d’O2. Dans une récente étude, l’un des fervents défenseurs de cette teneur réduite en oxygène a démontré que la présence de composés réducteurs dans le milieu, rendait cette réduction d’O2 totalement superflue (5). Les vitamines et les facteurs de croissance ont un statut spécial, qui sera discuté plus loin. 

Les acides aminés, Interface entre les deux problèmes : efficacité et problèmes d’empreinte et d’épigénèse.

Il est d’abord important définir l’épigénèse et les mécanismes associés à sa mise en place. Il faut noter, par ailleurs, que les mêmes mécanismes contribuent à l’établissement de l’empreinte. Ils sont indispensables au développement normal des mammifères, ils contribuent à des régulations géniques par activation ou down régulation de certains gènes. Dans le cas de l’empreinte parentale, un gène sera exprimé soit chez l’individu male, male soit chez la femelle. Cette régulation est très robuste. Dans l’épigénèse, la régulation peut être soit sexe dépendante soit pas ; par ailleurs elle peut être modifiée/perturbée par la nutrition et l’environnement. Le résultat en est une diversité phénotypique entre les individus. Le marquage épigénétique est essentiellement dû au processus de méthylation de l’ADN sur la cytosine au niveau d’Ilots CpG (déoxycytidine phosphate déoxyguanosine). Les modifications post traductionnelles (dont la méthylation) régulent l’épigénèse. Toutes ces modifications biochimiques et structurelles sont réalisées SANS MODIFICATIONS des séquences de l’ADN ; Elles pourront être réalisées soit directement au niveau des gènes soit au niveau des promoteurs.

Une idée, que l’on pourrait qualifier complètement « farfelue/hétérotypique », d’un point de vue biochimique , à savoir : la toxicité des aminoacides essentiels , dans la conception des milieux de culture, d’une part, associée d’autre part une fausse appréciation de la régulation de l’épigénèse et à la maintenance de la méthylation lors du développement préimplantatoire peuvent expliquer les errements épigénétiques observés en culture in vitro. Certaines bases biochimiques, causant des anomalies de méthylation donc de contrôle de l’épigenèse, récemment décrites (1,6-8) sont faussées lors du développement embryonnaire précoce.

Tous d’abord, il est parfois indiqué que le processus de déméthylation de l’ADN du noyau embryonnaire se produit immédiatement après la fécondation (9). Le modèle utilisé dans cette étude est un modèle in vitro, avec des milieux n’assurant pas le marquage épigénétique, et non confirmé in vivo (10). Ce concept est faux/incorrect ; La déméthylation se produit au moment de l’activation génomique (MZT, Maternal to Zygotic transition). Certes l’activité de méthylation de novo (DNMT3) est faible, mais l’embryon préimplantatoire possède une très forte activité de maintenance de la méthylation (10,11 ); la teneur en Méthyl cytosine est stable de la fécondation à la MZT.  Il est donc indispensable de fournir, dans le milieu de culture, les précurseurs nécessaires à la méthylation et les précurseurs des mécanismes de protection de celle-ci à savoir le glutathion (12) cofacteur de glutaredoxins et thiol-disulfide oxydoréductase enzymes protectrices contre le stress oxydant.

Figure : Interactions des cycles de la méthionine et des folates. Le folate naturel est le 5MTHF, 5methyltetrahydrofolate. L’acide folique est un composé synthétique qui doit être transformé avant d’entrer dans le cycle des folates. Sont métabolisme est lent et provoque le syndrome UMFA.la SAH et l homocysteine sont inhibiteur des méthylations. La 5MTHFR, quand soumise à des mutations/isoformes est un second goulot d’étranglement.

L’activité CBS (cystathionine beta synthase), amenant au recyclage de l’homocysteine en cystéine, permettant ainsi une synthèse de glutathion, protecteur universel contre le stress oxydant, est stimulée par les estrogènes. UMFA, UnMetabolized Folic Acid syndrome, est lié à la faible capacité métabolique de l’acide folique [26], composé de synthèse normalement absent des fluides biologiques, qui bloque l’entrée des folates naturels (apportés par la nutrition) par saturation des récepteurs.

Cela amène au deuxième concept erratique voir dangereux : la toxicité des aminoacides essentiels vs l’embryon, en culture embryonnaire (13). Cette assertion a immédiatement été contestée (14) mais perdure après avoir été reprise par les fabricants de milieux.  Une très belle publication montre que la qualité et la quantité de la méthylation de l’ADN de l’embryon est directement liée à la quantité de méthionine dans le milieu de culture (15.). Il est évident que l’omission de méthionine dans les milieux de culture ne facilite pas la qualité épigénétique de l’embryon ! Ceci confirme, par défaut, les travaux de Market Velker et al. (16,17) pour qui, AUCUN milieu de culture de l’embryon humain ne satisfait l’épigénèse embryonnaire. Alors qu’ils doivent passer le MEA, Mouse Embryo Assay (MEA), test sur l’embryon de souris, ils ne sont pas efficaces pour préserver l’épigénèse de cette espèce. Tout se passe comme si ce paramètre a totalement été ignoré, dès l’origine. De fait, la méthionine, précurseur de la synthèse de SAM, S-Adénosyl Méthionine, effecteur universel de la méthylation est indispensable.  Par ailleurs, le SAM libère, après méthylation des molécules cibles (ADN, Histones, Lipides) de le SAH, SA-Homocysteine puis l’homocysteine (Hcy), poisons cellulaires car inhibiteurs de la méthylation.  Hcy est une facteur délétère reconnu de la qualité ovocytaire (18). Hcy doit être recyclé en Méthionine par la conjonction de deux cycles métaboliques : le cycle des folates et celui de la méthionine. L’embryon préimplantatoire est parfaitement équipé, en ARNs messagers polyadénylés (donc immédiatement traduisibles en protéines actives), pour le recyclage de l’homocysteine (11), mais le milieu de culture doit être capable de fournir des folates, en l’occurrence le 5 Methyl THF (5MTHF), mais pas l’acide folique, qui est mal métabolisé. Nous reviendrons plus loin sur le problème posé par l’acide folique synthétique (19). Alors que l’embryon est parfaitement équipé pour incorporer le 5MTHF et la méthionine, une carence en ces deux métabolites amène à une surconcentration de Hcy délétère. Aucun milieu de culture ne contient de 5MTHF, de plus comme indiqué précédemment une partie d’entre eux ne contient pas de méthionine. La carence en méthionine induit des phénomènes d’apoptose dans les mitochondries, qui sont, rappelons-le, transmises par la mère. Si l’on rajoute l’absence de Cystine/cystéine précurseur du glutathion protecteur des marquages épigénétiques on ne peut être que circonspect…et confirmer les travaux de Market Velker et al. (16,17) quant à la capacité des milieux de culture à réaliser un marquage épigénétique correct. 

Comment peut-on aider l’ovocyte et l’embryon préimplantatoire à dépasser ce problème des milieux de culture ? : un support du cycle de la méthionine et du cycle des folates lors de la stimulation.

L’idée est de permettre à l’ovocyte d’accumuler les métabolites du cycle des folates et de la méthionine, pendant la phase de croissance folliculaire et surtout de maturation. Ainsi, il est susceptible de passer avec succès, in vitro, les premières étapes du développement embryonnaire préimplantatoire dans des milieux de culture imparfaits. Les premiers essais ont été réalisés avec succès sur le modèle bovin [20] avec un doublement du taux de blastocyste. La même observation a été récemment observée en FIV humaine [21]. Le traitement contient de la  vitamine B12, afin d’éviter le syndrome appelé Folate trap, qui amène à une augmentation de l’homocysteine, ce que l’on veut absolument éviter; Il contient du 5 Methyl THF, le folate directement utilisable pour régénérer l’ homocystéine ; il faut en effet éviter l’acide folique, mal métabolisé et susceptible d’engendrer le syndrome UMFA (Unmetabolized Folic Acid syndrome) source de problèmes de plus en plus décrits dans la littérature [19,22], surtout chez les patients porteurs des isoformes de la MTHFR (Methylene Tetra Hydro Folate Réductase) [19]. Cet acide folique non métabolisé peut bloquer les récepteurs au 5 MTHF, le folate directement actif dans le recyclage de l’homocysteine en méthionine. Le traitement contient aussi de la Vitamine B6, et du zinc sous une forme chelatée. La vitamine B6 est cofacteur des enzymes permettant la transformation de l’homocysteine en cystéine, précurseurs du glutathion.

Par ailleurs, le dosage de l’homocysteine devrait être effectué systématiquement chez tous les couples en recherche de grossesse [22], ceci est régulièrement effectué dans le cadre de notre activité. Cette approche a été reconnue par le Rotterdam consensus « Rotterdam periconception Cohort » qui confirme l’utilité du dosage de l’homocysteine [23]. L’identification des isoformes de la MTHFR est un ajout important, pour évaluer les risques potentiels pour les parents… et les enfants. Les maladies métaboliques liées aux isoformes MTHFR sont dramatiques (24). Un traitement de la mère pendant toute la grossesse et l’allaitement, de l’enfant jusqu’à la puberté, et après, éventuellement, en fonction de son homocystéinémie doit permettre d’éviter ces risques. Il s’agit là simplement d’une médecine préventive de bon aloi. Les traitements au MTHF associé à un support du cycle de la méthionine et des folates (notamment la vitamine B12) permet une chute drastique de l’homocysteine [26]

Conclusions :

On peut penser que les milieux de culture actuels sont globalement satisfaisants. Cependant, il est évident que l’efficacité de la technique FIV/ICSI est globalement assez faible, et mériterait d’être améliorée. La question des problèmes épigénétiques associés aux techniques d’AMP, mérite attention. Mais l’absence simplement de possibilité de compréhension et de vision des choses communes entre « régulateurs/administratifs et scientifiques » ne plaide pas en faveur d’une modification rapide des milieux. Le meilleur exemple de l’absence d’interactions est évident :  les données obtenues, des 2010 quant à l’épigénèse embryonnaire dans les milieux actuels [15-17], n’ont pas fait bouger les instances de régulation !

Aussi est-il   pertinent d’augmenter la capacité de méthylation de l’ovocyte et de l’embryon dès le début de la stimulation, afin de passer avec de meilleurs résultats possibles, la « situation délicate » que constitue le temps de culture in vitro. Pour cela, il faut clairement poser les problèmes des patientes.  Le bilan doit comporter impérativement le dosage de l’homocysteine, la vitamine D (qui est potentiellement impliquée dans l’épigénèse [27]. En cas d’élévation de l’homocysteine (>>8.5 µMolaire chez la femme et >>11.5 µMolaire chez l’homme [28]), le dosage de la vitamine B12 sera effectué, de même que l’identification des isoformes MTHFR 677C>T et 1298A>C, afin de déterminer où se situent les blocages. D’ailleurs, cette détermination des isoformes MTHFR devrait être réalisée quand l’infertilité est résistante. Dans tous les cas, l’association avec des cofacteurs des cycles des folates et de la méthionine (dont le Zinc, la B12, la B6) avec du 5 Methyl tétrahydrofolate, MTHF (mais pas de l’acide folique, trop dépendant de ses capacités métaboliques médiocres surtout à fortes doses [19,26]) sera privilégiée pour assurer une meilleure qualité embryonnaire [20,21].

Ainsi, l’approche scientifique du métabolisme embryonnaire in vitro amène à reconsidérer la préparation ovocytaire. Une analyse de l’homocystéinémie pour tous les couples en désir de grossesse est le reflet d’une bonne pratique médicale [23,26] ; indépendamment d’une amélioration de l’efficacité des techniques d’AMP, cette approche permet de déterminer certains risques quant à la santé des parents et plus encore d’éviter certaines pathologies métaboliques lourdes de l’enfant [24]

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1-Hiura H, Okae H, Miyauchi N, Sato F, Sato A, et al.  Characterization of DNA methylation errors in patients with imprinting disorders conceived by assisted reproduction technologies. Hum Reprod. 2012;27(8):2541-8

2-Sabbagh R, Mulligan S, Shah J, Korkidakis A, Penzias A, et al. From oocytes to a live birth: Are we improving the biological efficiency? Fertil Steril. 2023; 120:1210-1219

3-Kageyama A, Suyama A, Kinoshita R, Ito J, Kashiwazaki N.  Dynamic changes of intracellular zinc ion level during maturation, fertilization, activation, and development in mouse oocytes. Anim Sci J. 2022;93:e13759

4-Wooldridge LK, Nardi ME, Ealy AD Zinc supplementation during in vitro embryo culture increases inner cell mass and total cell numbers in bovine blastocystsJ Anim Sci. 2019 ;97:4946-4950.

5-Truong TT, Soh YM, Gardner DK. Antioxidants improve mouse preimplantation embryo development and viability. Hum Reprod. 2016; 31:1445-54. 

6-Choux C, Binquet C, Carmignac V, Bruno C, Chapusot C, et al.  The epigenetic control of transposable elements and imprinted genes in newborns is affected by the mode of conception: ART versus spontaneous conception without underlying infertility. Hum Reprod. 2018;33(2):331-340

7-Song S, Ghosh J, Mainigi M, Turan N, Weinerman R, et al. DNA methylation differences between in vitro- and in vivo-conceived children are associated with ART procedures rather than infertility. Clin Epigenetics. 2015; 8;7(1):41.

8-Menezo Y, Elder K, Clement P, Clement A, Patrizio P. Biochemical Hazards during Three Phases of Assisted Reproductive Technology: Repercussions Associated with Epigenesis and Imprinting. Int J Mol Sci. 2022 Aug 10;23(16):8916. 

9-Smith Z.D, Chan M.M, Humm K.C Karnik R, Mekhoubad S et al. DNA methylation dynamics of the human pre-implantation embryo. Nature 2014, 511, 611–615.

10-Menezo Y, Clément P, Dale B DNA Methylation Patterns in the Early Human Embryo and the Epigenetic/Imprinting Problems: A Plea for a More Careful Approach to Human Assisted Reproductive Technology (ART). Int J Mol Sci. 2019, ;20(6):1342.

11-Ménézo Y, Lichtblau I, Elder K.New insights into human pre-implantation metabolism in vivo and in vitro. J Assist Reprod Genet. 2013;30(3):293-303

12-Menezo YJ, Silvestris E, Dale B, Elder K Oxidative stress and alterations in   DNA methylation: two sides of the same coin in reproduction. Reprod Biomed Online. 2016; 33(6):668-683

13-Lane M, Hooper K, Gardner DK. Effect of essential amino acids on mouse embryo viability and ammonium production. J Assist Reprod Genet. 2001; 18:519–25.

14- Ho Y, Wigglesworth K, Eppig JJ, Schultz Preimplantation development of mouse embryos in KSOM: augmentation by amino acids and analysis of gene expression.RM. Mol Reprod Dev. 1995;41(2):232-8.

15-Clare CE, Pestinger V, Kwong WY, Tutt DAR, Xu J, Byrne HM et al. Interspecific Variation in One-Carbon Metabolism within the Ovarian Follicle, Oocyte, and Preimplantation Embryo: Consequences for Epigenetic Programming of DNA Methylation. Int J Mol Sci. 2021;22(4):1838. 

16- Market-Velker BA, Fernandes AD, Mann MR Side-by-side comparison of five commercial media systems in a mouse model: suboptimal in vitro culture interferes with imprint maintenance. Biol Reprod. 2010;83(6):938-50.

17-Market Velker BA, Denomme MM, Mann MR Loss of genomic imprinting in mouse embryos with fast rates of preimplantation development in culture.  Biol Reprod. 2012 ;86(5):143, 1-16

18-Razi Y, Eftekhar M, Fesahat, F, Dehghani Firouzabadi R, Razi N et al.  Concentrations of homocysteine in follicular fluid and embryo quality and oocyte maturity in infertile women: A prospective cohort. J. Obstet. Gynaecol. 2021, 41 (4), 588–593.

19-Menezo Y, Elder K, Clement A, Clement P. Folic Acid, Folinic Acid, 5 Methyl TetraHydroFolate Supplementation for Mutations That Affect Epigenesis through the Folate and One-Carbon Cycles. Biomolecules. 2022;12(2):197.

20-Golestanfar A, Niasari-Naslaji A, Jafarpour F, Rouhollahi S, Rezaei N et al. Metabolic enhancement of the one carbon metabolism (OCM) in bovine oocytes IVM increases the blastocyst rate: evidences for a OCM checkpoint. Sci Rep. 2022;12(1):20629. 

21-Kucuk T, Horozal PE, Karakulak A, Timucin E, Dattilo M. Follicular homocysteine as a marker of oocyte quality in PCOS and the role of micronutrients. J Assist Reprod Genet. 2023 Aug;40(8):1933-1941

22-Ménézo Y, Elder K, Clement A, Patrizio P, Brack M, et al.  Homocysteine testing is a significant predictor of health for couples trying to conceive and their future children. Epigenomics. 2023;15(21):1095-1099.

23- Rubini E, Snoek KM, Schoenmakers S, Willemsen SP, Sinclair KD, et al.  First Trimester Maternal Homocysteine and Embryonic and Fetal Growth: The Rotterdam Periconception Cohort. Nutrients. 2022;14(6):1129.

24- Yverneau M, Leroux S, Imbard A, Gleich F, Arion A, Moreau C et al Influence of early identification and therapy on long-term outcomes in early-onset MTHFR deficiency. Inherit Metab Dis. 2022;45(4):848-861

25- Clément A, Amar E, Clément P, Sedbon É, Brami C et al. Hyperhomocysteinemia in hypofertile male patients can be alleviated by supplementation with 5MTHF associated with one carbon cycle support. Front Reprod Health. 202; 5:1229997

26- Bailey, S. W., & Ayling, J. E. (2009). The extremely slow and variable

activity of dihydrofolate reductase in human liver and its implications for high folic acid intake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(36), 15424-15429.

27- Erdoğan K, Sanlier NT, Sanlier N Are epigenetic mechanisms and nutrition effective in male and female infertility? .J Nutr Sci. 2023;12:e103.

28- Clément A, Alvarez S, Jacquesson-Fournols L., Amar E, Brami C et al.    Women are More Protected than Men against Hhcy (Hyperhomocysteinemia) during their Reproductive Life: Gender-Related Differences in One-Carbon and Folate Cycles Metabolism. Archives of Clinical and Biomedical Research. 2023, 7: 345-352.