Lodovico Parmegiani¹ and Yves Menezo²

¹ Next Fertility GynePro – NextClinics International, Via T. Cremona 8, 40137 Bologna, Italy
² Laboratoire Clément, Génétique et PMA, Avenue d’Eylau, Paris 75016

Abstract

Cette mise au point plonge dans les interactions entre Procréation médicalement assistée et empreinte/épigénèse avec une approche plus spécifique sur la congélation embryonnaire mais aussi la vitrification ovocytaire de plus en plus utilisée actuellement, afin de permettre une procréation plus tardive. Cette dernière technique prend aussi totalement en compte les impératifs sociétaux relatifs au souhait des femmes quant à l’évolution de leur carrière ou de la stabilité conjugale : le Social Freezing, par ailleurs remboursés par de nombreuses compagnies anglo-saxonnes. Cette approche, contestée par une partie des gynécologues obstétriciens outre atlantique a engendré des questionnements quant à la préservation de l’épigénèse ovocytaire puis embryonnaire ; ce texte aborde les différents aspects de la vitrification susceptibles d’altérer le processus épigénétique : la formation de cristaux de glace, le stress oxydant, classiquement générés par tout type de congélation, les modifications de la structure(tertiaire) des Histones. Les études multi-omiques concernant l’évolution de nombreux types de molécules, réalisée chez l’animal commencent à apporter un certain nombre d’informations. L ‘évaluation des conséquences de la vitrification sur la survie embryonnaire mais encore et surtout sur la viabilité et la qualité embryonnaire et de l’enfant à terme pousse en faveur d’une recherche continue quant aux aspects technologiques mais aussi éthiques. Comme pour toutes les techniques de PMA, il est nécessaire de définir l’équilibre Bénéfice/ Risques, comme dans toute approche médicale en général, en ne perdant surtout pas de vue la sauvegarde de la santé des enfants  

Introduction

Une des raisons du succès de la congélation embryonnaire, et plus récemment de la vitrification ovocytaire en PMA, est la possibilité, pour les femmes de maitriser leurs choix quant à leur fertilité et la possibilité/volonté de fonder une famille, par une meilleure maitrise de l’espace-temps. La vitrification a permis de réaliser ce que la congélation embryonnaire classique (dite « lente ») ne permettait pas. Cependant des questions se posent de plus en plus quant à l‘innocuité de cette technique quant à préservation de la qualité des marquages épigénétiques.

Le marquage épigénétique

Il est d’abord important de définir l’épigénèse et les mécanismes associés à sa mise en place. Il faut noter, par ailleurs, que les mêmes mécanismes contribuent à l’établissement de l’empreinte. Ils sont indispensables au développement normal des mammifères, ils contribuent à des régulations géniques par activation ou down régulation de certains gènes. Dans le cas de l’empreinte parentale, un gène sera exprimé soit chez l’individu male, male soit chez la femelle. Cette régulation est très robuste. Dans l’épigénèse, la régulation peut être soit sexe dépendante soit pas ; par ailleurs elle peut être modifiée/perturbée par la nutrition et l’environnement. Le résultat en est une diversité phénotypique entre les individus. Le marquage épigénétique est essentiellement dû au processus de méthylation de l’ADN sur la cytosine au niveau d’Ilots CpG (déoxycytidine phosphate déoxyguanosine). Des modifications de structure concernent aussi les histones (protéines liées à l’ADN). Il en résulte une modification totale de la structure et la polarité de l’ADN, favorable ou défavorable à la transcription.  Les modifications post traductionnelles (dont la méthylation) régulent l’épigénèse. Des ARNs non codants participent à la régulation de l ‘épigénèse en bloquant soit la transcription (de parties codantes de l ‘ADN) soit la traduction de certains ARNs codants ;
Toutes ces modifications biochimiques et structurelles sont réalisées SANS MODIFICATIONS des séquences de l’ADN. Elles pourront être réalisées soit directement au niveau des gènes soit au niveau des promoteurs. Il est important de savoir que la mise en place de ces mécanismes, se fait, dans l’ovocyte, lors des dernières étapes de la maturation !! Lors des premières étapes du développement pré-implantatoire ces marquages sont maintenus. Il faut également noter que l’embryon humain est, lors de ses 3 premiers jours, totalement dépendant des réserves de l’ovocytes (ARNs et protéines). L’activité transcriptionnelle ne démarre que le 3eme jour.
Si l’on en revient à la vitrification, plusieurs paramètres peuvent être impactés :
1/ Toute opération de congélation/décongélation induit un stress oxydant qui impacte négativement le marquage épigénétique voire le détruit (Ménézo et al. 2016) Et ceci indépendamment des dégâts directs sur l’ADN via l’oxydation des bases et ici, plus particulièrement, au niveau des ilots de méthylation, Cytosine et guanosine. Rappelons que la guanine est la base de l’ADN la plus sensible à l’oxydation.
2/ Le processus de décongélation, (via les composés organiques ajoutés ou non, comme propanediol, DiMethylSulfoxyde etc…) peut induire une dénaturation de la structure tertiaire des protéines, donc des histones impliquées dans l’épigénèse. De plus les enzymes impliqués dans la maintenance épigénétique comme la DNA Méthyltransférase 1 (Ménézo et al…2019) peuvent aussi subir cette dénaturation, comme toutes les protéines impliquées dans le transport et la régulation des métabolites comme Méthionine et Cystine, impliqués dans le marquage épigénétique et sa protection (Menezo et al. 2019)
3/Les cryoprotecteurs, solvants organiques utilisés peuvent également altérer les lipides membranaires et ainsi altérer sa perméabilité et ainsi les transports moléculaires transmembranaires.
Ces dégâts, en l’absence de formation de cristaux de glace qui détruisent complètement la structure cellulaire sont, dans un premier temps plus ou moins silencieux/indétectables

L’ART de la cryopréservation : comment éviter la formation de cristaux

Au Cœur de toute cryopréservation, il est impératif d’éviter toute formation de cristaux, qui altéreront entièrement la structure cellulaire. L’équilibre entre l’addition de cryoprotecteur et la vitesse d’abaissement de la température doit être minutieuse, afin de permettre un échange « millimétré » entre l’eau cytoplasmique et le milieu extérieur hyperosmotique. Ceci tout en sachant que se produit un stress oxydant, une déformation structurelle de/des cellules, liée à l’hyperosmolarité. A ceci s’ajoute la toxicité des agents cryoprotecteurs (CPA, composés organiques). Tout ceci pouvant, bien sûr, interférer avec l’intégrité du génome et son marquage épigénétique, comme mentionné auparavant. 

Le stress oxydant et la teneur en oxygène en culture embryonnaire : un choix délicat.
Lors de la culture embryonnaire, se produit un stress oxydant, lié à la genèse de ROS : Reactive Oxygen Species, : composés réactifs oxygénés. Ces composés affectent négativement la qualité de l’embryon (Guérin et al. 2001). Il est à noter que, paradoxalement, les milieux actuels génèrent spontanément les ROS (Martin Romero et al. 2008). Il a été proposé de diminuer la teneur en oxygène du gaz, équilibrant le milieu de culture. Cette approche a été agréée et certains auteurs l’ont trouvé bénéfique (Kirkegaard et al., 2013; Vajta et al.2009 ). Cependant, très récemment, il a été montré qu’une meilleure adaptation des milieux avec notamment l’addition de composés réducteurs, rendait la réduction de la teneur en oxygène parfaitement inutile (Truong and Gardner 2017, Truong et al. 2022). Il est cependant évident que le stress oxydant affecte le marquage épigénétique (Ménézo et al. 2016) et peut amener à des hypo méthylation globale ou ciblée au niveau des promoteurs (Dattilo et al. 2016 ; Menezo et al., 2016)., en entrainant, bien sur des anomalies d’expression géniques (Verheijen et al. (2019). La désorganisation de la chromatine peut ralentir aussi la vitesse de la segmentation embryonnaire voire l’arrêter (Falk et al., 2018).

Mise en place de l’epigénèse” épigénétique : anomalies de méthylation et conséquence sur empreinte et épigénèse
Une déméthylation quasi totale de l’ADN se produit assez rapidement entre la MZT « Maternal to Zygotic Transition » passage du contrôle de développement dépendant totalement de la mère au contrôle embryonnaire vrai, lié aux transcriptions paternelles et maternelles. Puis des marquages métastables sont mis en place, liés au processus de méthylation. Cette méthylation peut se faire au hasard mais elle dépendra de l’environnement, mais dépendra aussi du génome embryonnaire, lui-même dépendant des génomes paternels (Kessler et al., 2018). D’après les observations de van Dongen et al. (2021), sur les jumeaux monozygotiques, certaines marques épigénétiques sont acquises avant l’implantation et sont conservées, jusque, et y compris l’état adulte (c’est le cas pour l’empreinte).   Ceci confirme nos observations sur la forte méthylation de maintenance durant les stades préimplantatoires [Ménézo et al. 2019, 2022]. Des différences de méthylation de l’ADN sont observées chez les enfants nés de PMA par rapport aux enfants conçus naturellement (El Hajj et al., 2017), avec des incertitudes sur d’autres variations épigénétiques chez l’adulte (Novakovic et al., 2019 ; Penova-Veselinovic et al., 2021). La FIV et la cryopréservation induisent une certaine vulnérabilité épigénétique (Cortessis et al. 2018 ; O’Doherty et al., 2015).

Modifications structurelles des histones : un terrain mal connu
Les limites, pour étudier ces modifications de structure tridimensionnelles, demeurent essentiellement technologiques : mais une fois de plus, la méthylation est impliquée. Elle modifie et la structure tertiaire et la polarité des histones impliquées (Les groupements méthyl diminuent la polarité et la capacité des molécules à s’ioniser)
Récents travaux ont montré des variations/modifications de méthylation au niveau de la Lysine (H3KMe) dans les cellules du cordon des bébés IVF.  (Chen et al., 2020; Yang et al., 2021). Les variations les plus notables sont observées pour l’ICSI et la congélation embryonnaire (Chen et al., 2020). La vitrification décroît le niveau d’acétylation des histones H3Lysine9ac et H3Lysine27ac en culture embryonnaire (Jahangiri et al. 2018 ; Truong and Gardner, 2020).

Analyse de l ‘expression génique et l’impact des MicroRNAs (non codants) par la multi-omique :  génomique, métabolomique, transcriptomique et protéomique.
Tout d ‘abord, il est établi que la congélation diminue le contenu en ARNs messagers de l’ovocyte, sans toutefois, apparemment, totalement impacter ses capacités de développement (Chamayou et al. 2011).  Il existe une différence dans l’expression génique dans le sang de cordon des enfants résultants d’un transfert d’embryon congelés (i Chen et al., 2020). Par ailleurs les études réalisées chez la souris indiquent également que le profil des microARN est modifié par la vitrification (Azizi et al., 2021). Le spectre des microRNAs est diffèrent avant et après activation génomique (MZT), ce qui est conforme à ce que l’on peut attendre (Zhao et al. 2015).  Il faut rappeler que ces microRNAS, régulent la cinétique du développement préimplantatoire en régulant la cinétique de traduction des ARN messagers Polyadénylés stockés dans l’ovocyte : ils ne doivent pas être traduit simultanément, mais permettre de « tenir » le métabolisme pendant 3 jours, jusqu’au début de transcription embryonnaire vraie au moment de la MZT, Maternal to Zygotic transition. Dans une récente synthèse, Shadmanesh & Nazari (2023), confirment bien que les RNAi sont bien modifiés par la vitrification, sans conséquences apparentes. Il reste que les RNAi sont aussi potentiellement impliqués dans l’établissement/régulation de l’empreinte. Une recherche poussée des causes et conséquence est totalement incontournable.

Que dit la recherche chez l’animal ? Des risques liés à la vitrification ?
La littérature est globalement difficile à cerner et ambigüe (Zhu et al. 2023 ; Chen et al. 2022) Certains travaux conteste les anomalies moléculaires associées à la congélation (souris, chien, porc). D’autres au contraire mettent en garde (mouton, bovin, souris) [Shadmanesh & Nazari (2023]. Mais il ressort quand même que des variations métaboliques/moléculaires, sans pouvoir en définir réellement les conséquences. Là encore il existe une interférence liée aux cryoprotecteurs utilisés : éthylène glycol, Glycerol ou DMSO et au stade de maturation ovocytaire et/ou de développement embryonnaire. IL faut noter cependant que la technique de vitrification est peu ou pas (encore) utilisée en transfert embryonnaire (de blastocystes) chez les bovins.

Impact de l’immersion directe dans l’azote liquide
Cette technique est à l’heure actuelle (depuis 10 ans déjà), le « golden standard » surtout pour la congélation d’ovocytes : elle double le taux de récupération/viabilité après décongélation. Elle a permis la naissance de plus de 3000 bébés, après FIV. Elle a complétement rendu obsolète la technique dite « slow freezing » : abaissement lent de la température. Plus de la moitié des bébés FIV sont, en Italie issus de cette technique de vitrification (Alikani and Parmegiani, 2018, PMA registry, NIH report on 2021 activity,2023)

Les inquietudes concernant la cryoconservation ?
A l’heure actuelle, la tendance est plutôt, pour les embryons, à la congélation au stade blastocyste, bien que l’on n’ait pas de certitudes absolues quant à la santé des enfants. Si les études morphologiques/ morphologiques sont bonnes, les analyses épigénétiques   complètes n’ont pas été réalisées. Il est évident que les études utilisant des nouvelles technologies analytiques doivent être faites, afin, a minima, de lever les doutes.  (Reyes Palomares and Rodriguez-Wallberg, 2022). Si, dans quelques cas, la congélation des embryons a amené à des malformations congénitales, la comparaison avec la vitrification n’est pas concluante, compte tenu des différentes sources d’infertilité, mais aussi des différences de technologies employées (stimulation) ou encore des cryoprotecteurs employés (Davies et al., 2012; Belva et al., 2016; Mann et al., 2004). L’impact sur les variations épigéniques, chez l’enfant est encore largement inconnu (Sciorio et al., 2023).

Vitrification : Mythes, croyances et réalité scientifique
La vitrification des ovocytes est indubitablement une technologie croissante. On n’observe pas plus d’aneuploïdie embryonnaire. Reste le problème de l’impact des cryoprotecteurs (Kwan 2023), qui sont, rappelons-le des solvants organiques. La quantité de cryoprotecteur entrant dans les cellules est plus faible en vitrification, qu’en congélation lente programmée. Pour Vanderzwalmen et al. (2013), les problèmes viendraient plutôt du manque d’expertise en vitrification des opérateurs.

Un effet du temps de maintenance à l’état congelé ?
On pourrait penser que le temps passé à l’état congelé altère l’embryon : les taux de survie à la décongélation sont similaires quelle que soit la durée. Les facteurs annexes l’âge maternel, (nous reviendrons sur ce point), les caractéristiques basales connexes sont probablement plus importantes que la durée de stockage a l’état congelé (Li et al., 2020 ; Parmegiani and Vajta, 2020).

Une augmentation des risques de Cancer chez l ‘enfant ? Risques réels ou méconnaissance de l’évolution de la cryobiologie ?
A la cryoconservation est associé une légère augmentation des risques de Cancer chez l’enfant. (Haergreave et al 2020). Mais il faut différencier les différentes techniques de cryopréservation (Parmegiani and Vajta 2020, Vajta et al. 2022). Une autre étude semble confirmer cette augmentation. (Sargisian et al., 2022) ; De nombreux auteurs contestent l’utilisation de la cryoconservation « de convenance » i.e Social Freezing, à une large échelle. Il est important de citer ici les recommandations de l’ASRM et le collège américain des gynécologues obstétriciens :
“caution against the marketing of egg freezing for elective purposes (i.e., oocyte cryopreservation to preserve fertility potential, without a medical indication), warning of insufficient data addressing outcomes related to healthy women wishing to circumvent reproductive aging, and that voluntary oocyte cryopreservation might offer false hope and encourage women to delay childbearing” cité par Feuer et Rinaudo (2016) .
Il s ‘agit d’une mise en garde contre l’utilisation abusive de la congélation d’ovocytes, afin de retarder les grossesses… Il est évident que d’une façon ou d’une autre, l’âge maternel est un problème pour la grossesse qui ne dépend pas uniquement de la qualité ovocytaire !!! Il faut noter que ce n’est que récemment que la vitrification a pris le pas sur toutes les autres techniques de cryoconservation. (Vajta et al.  2022). Les études de Haergreave and Sargisain’s couvrent une période de 30 ans. 28% des 171.774 enfants étudiés sont nés entre 2011 et 2015. De plus la majorité (92%) des transferts d’embryons congelés étaient réalisés au stade cellulaire et non pas au stade blastocyste. La vitrification semble avoir totalement changé la donne ; la vitrification serait l’un des progrès majeurs de la PMA. On ne peut pas mélanger, dans les études rétrospectives, les résultats obtenus avec les différentes technologies et les différents stades de congélation : ceci peut entrainer une confusion potentiellement source d’inquiétude.  Enfin, n’oublions pas que les milieux de culture employés pre ou post congélation, sont eux-mêmes générateurs de stress oxydant (Martin Romero et al. 2008) et de troubles de marquage épigénétiques (Market Velker et al.  2010,2012).

Conclusions

La sécurité sanitaire de la vitrification, est comme toute innovation dans ce domaine, au croisement de la science et de l’éthique. Le problème qui semble émerger est l’impact sur l’épigénèse embryonnaire. Mais il faut considérer le ratio Bénéfice/risques, comme dans toutes les étapes de la PMA : la genèse d’enfants sains est une priorité. Il faut bien sur poursuivre la recherche sur les enfants nés de cette technique : mais aussi, pour les études encours, celles-ci doivent être réalisées bien sûr par des statisticiens et des épidémiologistes mais aussi en association avec des experts en cryobiologie. En effet trop de facteurs divergents impactent, pour l’instant, ces études. Citons, les différentes techniques utilisées, les différents cryoprotecteurs, l’expertise apportée par la durée d’utilisation. Tout ceci ne peut qu’apporter des observations, en tous cas, utiles, quelles qu’en soient les conclusions. …. 99% des centres de FIV au monde, utilisent la vitrification, au moins pour les ovocytes.

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